La technique RFLP :

En 1980 Botstein et Coll ont publié une carte génétique du génome humain qui, pour la première fois, utilisait des marqueurs génétiques issus de la technique de polymorphisme de longueur des fragments de restriction (de l'anglais Restriction Fragment Length Polymorphism, ou RFLP). Cette technique a eu immédiatement un gros succès auprès des généticiens, car elle donnait accès à un nombre très élevé de marqueurs répartis le long du génome.

En utilisant une enzyme de restriction le génome d'un individu va être découpé en plusieurs parties dépendant du nombre de sites de restriction présents dans le génome de l'individu pour l'enzyme utilisée. Le nombre de ces sites et leurs positions diffèrent en fonction de l'individu. On a donc un polymorphisme de longueur des fragments de restriction, et l'on peut donc réaliser une empreinte génétique d'un individu grâce à cette méthode. Ainsi on pourra différencier deux individus. Lorsque deux individus homozygotes sont comparés après digestion de leur ADN par une enzyme donnée et hybridation avec une sonde donnée (voir Southern Blot), on observera des profils d'électrophorèse différents chaque fois que des sites de restriction différeront.

Les étapes de la technique de RFLP :

1) Extraction de l'ADN des différents génotypes à analyser

2) Digestion de l'ADN par un enzyme de restriction. On obtient alors des fragments d'ADN de longeurs différentes selon les individus. Cette différence de taille est due a une différence du nombre de site de restriction qui varie selon les individus ; l'ADN à analyser est alors couper en fragment plus ou moins long du au polymorphisme de longueur des fragments de restriction.

Les étapes qui suivent servent à visualiser les différents fragments d'ADN obtenus :

3) Les fragments de restriction sont séparés selon leur taille par une électrophorèse en gel d'agarose. L'ADN étant chargé négativement, il migre de la cathode vers l'anode. Les fragments les plus petits sont les plus rapides.

4) L'ADN est transféré sous forme dénaturée sur une membrane de nylon. La position relative des fragments d'ADN est préservée durant le transfert.

5)Méthode du Southern Blot :

La membrane est incubée dans une solution contenant une sonde marquée préalablement, soit par la radioactivité, soit chimiquement. La sonde s'hybride alors avec le ou les fragments d'ADN avec lesquels elle présente une homologie. On utilise couramment deux sources de sondes, les sondes génomiques (ADNg) et les sondes d'ADN complémentaire (ADNc). Les sondes génomiques sont obtenues par digestion de l'ADN total du génome nucléaire de l'espèce étudiée à l'aide d'un enzyme de restriction. Les sondes d'ADNc correspondent nécessairement à des gènes exprimés, puisqu'elles sont obtenues à partir des ARN messagers.

6) L'endroit, ou les endroits, où la sonde s'est fixée sont révélés en plaçant la membrane au contact d'un film sensible à la radioactivité (figure), ou en réalisant une réaction enzymatique colorée spécifique. Les étapes 4 à 6 correspondent à la technique de Southern.

Les applications de la technique de RFLP :

La construction de cartes de liaisons génétiques, avec leurs multiples intérêts : localisation de gènes majeurs, analyse de la recombinaison, cartographie de gènes.

D'autres méthodes de marquage, fondées sur la PCR, sont maintenant en train de supplanter la RFLP pour diverses applications, mais celle-ci reste encore très utilisée lorsque l'on recherche des marqueurs codominants et spécifiques de locus. Elle reste la technique de choix pour les travaux de cartographie comparée, qui se sont beaucoup développés ces dernières années. Enfin dans le domaine de l'évolution moléculaire, elle permet la comparaison de cartes de restriction pour des locus particuliers, dans le but d'établir des phylogénies de gènes.

 

Voici une animation illustrant la technique RFLP :